Von 1952 bis 1954 diente er als Oberleutnant bei den Marines und war nach Korea und Japan im Einsatz. Er studierte in Yale bei Edmund S. Morgan, dem renommierten Historiker des Puritanismus und des Koloniallebens, der ihn über 50 Jahre prägte. Nach seinem Ph.D. 1961 wechselte er an die University of California, Berkeley, wo er lehrte und in den 1970er und frühen 1980er Jahren verschiedene Verwaltungspositionen bekleidete.
1983 wurde Professor Middlekauff Direktor der Huntington Library in San Marino in Südkalifornien, deren Ressourcen er der Öffentlichkeit zugänglicher machte. 1988 kehrte er nach Berkeley zurück und sagte, er habe den Unterricht versäumt.
Zu den Doktoranden von Professor Middlekauff in Berkeley gehörten die Historiker Ruth Bloch, E. Wayne Carp, Jacqueline Barbara Carr, Caroline Cox, Charles Hanson, Richard Johnson, Carolyn Knapp, Mark Cachia-Riedl, Charles Royster und Bill Youngs.
Bevor er „A Glorious Cause“ schrieb, hatte Professor Middlekauff „Ancients and Axioms: Secondary Education in Eighteenth-Century New England“ (1963) und „The Mathers: Three Generations of Puritan Intellectuals, 1596-1728“ (1971) veröffentlicht, in denen die Entwicklung der puritanischen Theologie und des Denkens durch das Leben und die Arbeit der Minister Richard, Increase und Cotton Mather, die sich auf private Papiere und unveröffentlichte Schriften sowie Predigten stützen. Es gewann 1972 den Bancroft-Preis, eine der renommiertesten Auszeichnungen in der amerikanischen Geschichte.
In „Benjamin Franklin and His Enemies“ (1996) verfolgte Professor Middlekauff einen ungewöhnlichen Ansatz und konzentrierte sich auf Franklins persönliche Beziehungen und die Emotionen (insbesondere Wut), die sie hervorriefen. Er beschrieb Franklins Konflikt mit Thomas Penn, dem Besitzer der Pennsylvania-Kolonie (und dem Sohn ihres Gründers); John Adams; und Franklins eigener Sohn William. Das daraus entstehende Porträt ist komplizierter als die üblichen Ansichten von Franklin als selbstgefälliger Bürger oder genialer alter Mann.
Die Arbeit an der Überarbeitung von „The Glorious Cause“ weckte die Neugier von Professor Middlekauff auf George Washington, die, wie er John Fea in einem Interview im Online-Journal Current sagte, „nicht ganz zufrieden war“. Edmund Morgan, sagte er, habe ihn “nachdrücklich ermutigt”, “einen weiteren Versuch in Washington zu unternehmen”. Das Ergebnis war „Washington’s Revolution: The Making of America’s First Leader“ (2015).